Sodium azide

۱ml

۰.۵cc

Triton X-114 0/5%

۲ml

۱۰cc

Glycerol10%

۰.۳۰۸g

۱.۵۴۲g

۱۵۴.۲

DTT10mM

۰.۸۵۴g

۴.۲۷g

۳۴۲.۳۰

Sucrose12/5mM

Up to 200ml Tris 10mM

مهارکننده پروتئاز۱: یک عدد قرص ^[۷۴]PI Cocktial در ۲۰ میلی­لیتر آب مقطر استریل حل ­گردید.
مهارکننده پروتئاز۲: از محلول PMSF^[75] ۱میلی­مولار استفاده شد که در حلال آلی DMSO^[76] حل شد، وزن مولکولی PMSF400 میلی­مولار ۲/۱۷۴ گرم است که در ۵ میلی­لیتر از DMSO حل گردید.
محلول EDTA 10 میلی­مولار: وزن مولکولی EDTA 100 میلی­مولار ۲/۲۹۲ گرم، درنتیجه ۴۶/۱ گرم از آن را در ۲۰ میلی­لیتر آب مقطر ۲ بار تقطیر اضافه کرده و چون PH محلول اسیدی بود به وسیله NaOH آن را نرمال کرده و در نهایت حجم به ۵۰ میلی­لیتر ­رسید.
۳-۸-۱-۳. روش کار
به رسوب (کلونی باکتری) مرحله قبل هر سویه، ۱۵ میلی­لیتر بافر تخلیص اضافه کرده سپس frezz-thaw به وسیله ازت مایع و آب جوش انجام ­شد، این مرحله بیش از ۲۰ بار تکرار ­شد.
۵/۱ میلی­لیتر از محلول EDTA 10 میلی­مولار به محلول­های پیش اضافه ­گردید.
مهارکننده پروتئاز۱ نیز اضافه گردید.
در این مرحله محلول آماده سونیکاسیون شد. هر بشر را بدلیل جلوگیری از شکسته شدن از گرمای حاصله از سونیکاسیون در ظرف یخ گذاشته، آن را در دستگاه قرار دادیم. سونیکاسیون به مدت ۱ ساعت با پالس ۵۰-۴۷ دستگاه انجام ­گرفت.
مهارکننده پروتئاز۲ به مقدار ۵۰ لاندا به محلول­های پس از سونیکاسیون اضافه ­گردید.
محلول­ها با rpm 3000 و به مدت یک ساعت و در دمای۳- درجه سانتی ­گراد سانتریفیوژ ­گردید.
بعد از انجام سانتریفیوژ محلول رویی برای مراحل بعدی نگهداری شد و برای صحت درستی عمل سونیکاسیون از رسوب آن لام تهیه گردید و رنگ­آمیزی ذیل نلسون انجام ­گردید.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۸-۱-۴. استخراج پروتئین­های ترشحی
پس از عمل سانتریفیوژ مرحله ۳-۸، محلول رویی حاصله برای اطمینان بیشتر از عدم حضور باسیل احتمالی با فیلتر ۲/۰ میکرون فیلتر گردید.
۳-۸-۲. خالص­سازی پروتئین
در این مرحله ناخالصی­های پروتئین مانند لیپیدها حذف ­شدند.
۳-۸-۲-۱. مواد مورد نیاز
محلول اشباع سولفات آمونیم ۷۰%، محلول PBS^[77] x1، الکل ۶۰%، دستگاه سانتریفیوژ یخچال­دار و کیسه دیالیز
۳-۸-۲-۱-۱. آماده ­سازی محلول­ها و مواد
محلول اشباع سولفات آمونیم ۷۰% : اصول این کار بدین صورت است که مقدار محلول اشباع سولفات آمونیم را بسته به حجم نمونه­های محلول، ازفرمول زیر محاسبه می­ شود:
۱۰۰X=70 (sample’s volum + X)
X =مقدار سولفات آمونیم اضافه شده به هر نمونه
پس از وزن کردن سولفات آمونیم ، کم کم به آب دو بار تقطیر اضافه می­گردید.
محلول PBS x1: طبق جدول زیر محلول PBS x10 آماده گردید (PH محلول خود روی ۳/۷ تنظیم می­ شود) و در این راستا محلول PBS x1 مورد استفاده با آب دوبار تقطیر آماده شد.
جدول۳-۳: مواد تشکیل دهنده محلول PBS x10